각각의 리가아제만
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EGFR-ubitaAb-v1에 비해 EGFR-ubitaAb-v2의 활성이 향상되었음을 확인한 후, RNF43과 ZNRF3를 동시에 표적하는 것이 각각의 리가아제만을 표적하는 것보다 기능적으로 유리한지 조사했습니다. 경쇄 융합 구조의 우수한 성능을 바탕으로, EGFR-ubitaAb-v3와 EGFR-ubitaAb-v4에서는 각각 항-RNF43 및 항-ZNRF3 나노항체를 경쇄 N-말단에만 융합했습니다. 그런 다음, RNF43 또는 ZNRF3를 선택적으로 표적하도록 설계된 EGFR-ubitaAb-v2와 EGFR-ubitaAb-v3 및 EGFR-ubitaAb-v4의 세포 내 유입 능력을 비교했습니다( 그림 2D ). 10 nM 농도에서 48시간 동안 처리했을 때, EGFR-ubitaAb-v2는 가장 높은 세포 내 유입 효율(82.7%)을 보였고, 그 다음으로 EGFR-ubitaAb-v3(63.0%), EGFR-ubitaAb-v4(51.7%) 순이었다. 이러한 결과는 유전자 조작된 RSPO2 변이체를 통한 RNF43 및 ZNRF3의 이중 표적화가 항체 세포 내 유입을 시너지 효과적으로 향상시킨다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 RSPO2 또는 나노바디 모듈을 통해 막 결합형 E3 리가아제를 모집하도록 EGFR 항체를 설계하면 유비퀴틴화 의존적 메커니즘을 통해 세포 내 유입과 수용체 분해가 모두 향상됨을 보여줍니다. 테스트된 모든 변형체 중에서 EGFR-ubitaAb-v2가 가장 높은 기능적 활성을 나타냈으며, 후속 ADC 구축을 위한 선도 후보로 선정되었습니다.
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